导向编辑系统（Prime Editing, PE）是能够在基因组的靶位点处实现任意碱基替换、小片段精准插入和删除的新型基因组编辑工具，是基因组编辑领域的重大变革。近日，上海科技大学生命学院陈佳研究组与黄行许研究组等合作在导向编辑系统的安全性评估和升级改造中接连取得突破性进展，相关成果分别发表于3月14日的国际学术期刊The CRISPR Journal，以及3月29日的国际学术期刊《自然-通讯》（Nature Communications）。
脱靶问题长期困扰着基因编辑技术的发展和应用——如果脱靶现象普遍发生，对被编辑细胞来说将产生无法预料的后果，也意味着该编辑系统无法应用到实际的治疗中去。尽管导向编辑系统（PE）相比早前的基因编辑系统在编辑功效方面有了显著的改进，但其在全基因组和全转录组水平的脱靶效应及在不同位点处的编辑效率差异制约着PE在基础科研和临床研究中的推广。
虽然已有报道表明PE系统只会产生少量的pegRNA依赖性的脱靶突变，但是联合团队想要验证它们是否可能在人类细胞中产生另外一种更为严重的随机突变——pegRNA非依赖性的脱靶突变。他们通过在特定细胞中敲除某内源性基因构建了一种背景突变数量极低的细胞系，并分别检测相关单克隆细胞中的突变数量，并在全基因组和转录组范围内分析PE3的编辑特异性。同时，结合基因组和转录组数据进行了全方位的比对和分析，发现PE3在靶位点处介导高效编辑的同时，并未在全基因组和全转录组范围内检测到PE3产生的pegRNA非依赖性的脱靶效应，证明了PE3系统的高特异性 。这些结果为利用PE3开展高精度的基因编辑应用提供了理论基础。
图1. 在细胞水平上通过检测编辑的单克隆细胞来分析PE是否存在脱靶突变方法的模式图。
PE在不同的编辑位点处的编辑效率千差万别，制约着其广泛应用。为此，联合团队通过规律性引入同义突变和pegRNA骨架优化，突破性地开发了新型导向编辑系统sPE和aPE，提高了整体编辑效率。
针对PE介导的单碱基转换，团队开发了spegRNA并与PE3系统整合构建了sPE3。相比原始版本的PE3，该系统显著提高了碱基转换效率。相关实验显示，优化的spegRNA可将碱基转换效率平均提高353倍（最高提高4976倍），并在原始版本的PE3无明显编辑（编辑效率低于3%）位点处将编辑效率提高至40%到80%。
图2. spegRNA可介导更高效率的碱基转换
针对PE3介导的碱基精确插入/缺失，研究团队通过分析pegRNA骨架，改造发夹结构中的碱基对，并整合构建了更高稳定性的aPE3系统，使相关效率平均提高了2.77倍，最高提高10.6倍。同时，spegRNA和apegRNA联合使用可进一步提高碱基转换和插入/缺失效率，还能够与PE5系统整合并提高编辑效率。
图3. apegRNA能够介导更高效率的碱基精确插入/缺失
上述两项PE的安全性评估和升级改造研究为其在基因治疗领域的广泛应用提供了理论基础和科学依据。在第一项研究中，上科大生命学院2016级博士生高润泽、中科院2019级硕博连读研究生付志灿和上科大生命学院2018级硕博连读研究生李向阳、中科院博士毕业生王滢为共同第一作者，陈佳、杨力、黄行许为共同通讯作者。在第二项研究中，上海市第一人民医院副研究员李潇飒（上科大生命学院2019届博士毕业生）、上科大生命学院2018级硕博连读研究生周丽娜和中科院2019级硕博连读研究生高宝青为共同第一作者，陈佳、杨力、孙晓东、李潇飒为共同通讯作者。两项研究均得到了科技部、国家自然科学基金委和上海市科委的经费支持。
The CRISPR Journal论文标题:Genomic and Transcriptomic Analyses of Prime Editing Guide RNA–Independent Off-Target Effects by Prime Editors
链接：https://www.liebertpub.com/doi/10.1089/crispr.2021.0080
Nature Communications论文标题: Highly efficient prime editing by introducing same-sense mutations in pegRNA or stabilizing its structure
链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-29339-9