近日，上海科技大学生命学院马涵慧课题组在学术期刊 Protein & Cell 上发表研究论文，报道了三种高效灵活的先导基因编辑工具的开发：3’-Stem loop PEs（sPEs）、Tethered PEs（tPEs）和Split pegRNA PEs（SnPEs）。
绝大多数遗传性疾病都是由于基因上的位点突变、插入或缺失导致的。2019年，MIT的David Liu团队开发出了一款基于CRISPR的先导编辑（Prime editor，PE）编辑器，这款编辑器能够在不引入双链DNA断裂的情况下，无需额外添加供体模板，便可实现点突变、DNA片段插入或筛除。但是PE编辑器在很多基因位点的编辑效率非常低，因此，提高PE的编辑效率仍是一个亟需解决的问题。
图1 | PE编辑器发挥作用需要经过以下五个步骤：组装、搜索、靶向、定位、编辑。在这个过程中，pegRNA被降解或者自身环化以及pegRNA的3’端在复合物形成后进入Cas9与5’端的spacer结合都会影响对目标位点的靶向，最终影响编辑效率。
团队从先导编辑器靶向目标DNA效率入手研究，利用团队此前开发的CRISPRainbow成像技术，发现PE编辑器的DNA靶向效率非常低，这有可能由于pegRNA自身的稳定性或非正常的折叠，也可能是由于组装的Cas9/pegRNA的DNA靶向能力下降。而其目标DNA靶向能力可以通过在pegRNA的3’-末端加RNA适配体（比如pegRNA-MS2）得到恢复 。
图2 | 使用CRISPR成像系统的三种系统的示意图。在使用GE和PE-MS2系统的细胞中可以观察到有亮点出现，说明这两种系统可以很好地靶向目标位点；在使用PE系统的细胞中几乎无法观察到有亮点出现，说明PE系统不能很好地靶向目标位点。
基于这一发现，团队开发了一系列优化的PE基因编辑系统，包括3’-Stem loop PEs（sPEs）、Tethered PEs（tPEs）和Split pegRNA PEs（SnPEs）。通过在pegRNA的3’端添加RNA 适配体（sPE）以及在Cas9上连接RNA 适配体的结合蛋白（tPE），发现sPE和tPE系统在不同细胞中的编辑效率相比于PE均有所提高，尤其是在片段插入与筛除的应用中编辑效率远高于PE系统。同时为了增加更多改造的灵活性，作者将pegRNA拆分为sgRNA和pRNA （prime RNA）。SnPE不仅解决了在插入与缺失大片段时pegRNA难以稳定存在的问题，还为诱导型先导编辑系统（iPEs）提供了良好的基础。
图3 | PE、sPE、tPE、SnPE系统的示意图。PE、sPE和tPE在HeLa细胞中10个不同位点的基因编辑效率。使用不同RNA适配体的SnPE系统在293FT细胞中RUNX1位点诱导三碱基插入和删除的编辑效率。
上科大生命学院访问生、华东理工大学博士研究生冯颖，上海科技大学生命学院2020级研究生刘思远为共同第一作者，上海科技大学生命学院助理教授马涵慧为通讯作者。
论文标题：Enhancing Prime Editing Efficiency and Flexibility with Tethered and Split pegRNAs
论文链接：
https://academic.oup.com/proteincell/advance-article/doi/10.1093/procel/pwac014/6645197